摘要：
酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)具有非常好的后翻译系统,遗传背景清晰,基因操作简便,真核生物酿酒酵母作为一种表达宿主被广泛应用于具有医药、工业价值的异源蛋白的表达。选择合适的表达载体是异源蛋白在酿酒酵母中表达时首先需要考虑的问题,纵观酿酒酵母整合方法发展史,整合位点的选取以及筛选标记的选择是研究者普遍关注的方向。在酿酒酵母中,2μ游离质粒在细胞中可存在大约5-30个质粒,虽然2μ高拷贝质粒有利于异源基因的高效表达,但在长期无筛选压力培养条件下往往存在易丢失、不稳定的弊端。而基于rDNA和δ位点的整合表达方法是异源蛋白在酿酒酵母中表达的另一策略。rDNA在酿酒酵母染色体XII上存在140个随机重复序列,δ位点则分布于不同的染色体上,存在425个随机重复序列。筛选标记从最初的营养筛选标记发展到以抗性基因kan作为新的筛选标记,并通过不同抗性浓度梯度筛选更高拷贝数。Kan作为筛选标记的δ整合方式是目前大家普遍利用的整合方法,但这一方法却存在明显弊端,即假阳性严重,高浓度kan会对细胞造成毒性,且kan的外源添加不适合酿酒酵母进行工程发酵。综上可知,基于δ位点的整合方法已在酿酒酵母中广泛应用,但同时实现异源基因的高拷贝整合和稳定表达仍然面临挑战。磷酸丙糖异构酶(TPI1),催化三磷酸甘油醛和磷酸二羟丙酮之间的互换异构,TPI1缺失菌株tpi△无法正常进行糖酵解途径,产生足量乙酰辅酶A进行三羧酸循环,为细胞正常生长供能,故无法在以葡萄糖作为唯一碳源的培养基上进行正常生长,可在以葡萄糖、乙醇作为碳源的培养基上正常生长。来自于粟酒裂殖酵母中的磷酸丙糖异构酶(POT1),其相比于酿酒酵母中的TPI1在功能上存在明显缺陷,本研究利用P0T1这一必需基因作为δ整合方法中的新型筛选标记,利用POT1的功能缺陷,筛选多拷贝整合的异源基因。在这一整合方法中,选取TP1启动了、TPI1终止子用于异源基因的表达,以期促进基因的转录后调节,提高蛋白的表达量。为突出POT1介导的δ整合方法的优势,我们将此方法与传统URA3介导的δ整合方法进行了比较,发现新型整合方法可获得更高拷贝数及蛋白表达量。POT1介导的δ整合方法轻松获得了32个拷贝的绿色荧光蛋白表达菌株,且该菌株在丰富培养基中传代100代后基因拷贝数及蛋白表达量仍然保持稳定。酿酒酵母作为传统的乙醇生产菌株,是极具潜力的CBP底盘细胞,目前已广泛应用于纤维素产醇的研究。纤维素的降解通常采用纤维素酶酶解的方法,主要需要包括内切葡聚糖酶(Endoglucanase,简称EG)、纤维二糖水解酶(Cellobiohydrolase,又称外切葡聚糖酶,简称CBH)和β-葡萄糖苷酶(β-Glucosidase,简称BGL)在内的多种纤维素酶的协同作用才能将纤维素转化成葡萄糖。其中外切葡聚糖酶在酿酒酵母中的高效表达是纤维素产醇研究中的瓶颈。利用POT1介导的δ整合方法,本研究成功实现了棘孢曲霉来源的外切葡聚糖酶的稳定、高拷贝表达,最高酶活达238 mU g-1,为目前报道中的最高酶活。本研究将δ序列作为整合位点,将POT1这一必需基因作为筛选标记成功实现了异源基因在酿酒酵母中的稳定、高效表达。P0T1介导的δ整合方法将会是一种异源蛋白在酿酒酵母中稳定高效表达的有力工具,具有极大的医药、工业应用价值。
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