摘要：
近些年来,医疗器械被广泛应用于现代医疗系统中。由于越来越多的医用材料被应用于体内移植手术当中,从而间接地提高了病人与微生物接触的可能性,医疗过程中的细菌感染问题始终是现代医疗的一个巨大挑战。特别是,目前应用于医疗器械的大部分材料属于疏水性材料,而研究表明大部分细菌更易于在疏水材料的表面进行吸附。因此进行抗菌医用材料的研究就显得十分重要。真菌疏水蛋白是由高等丝状真菌在特定时期产生的一类具有特殊理化性质的小分子量蛋白质,是已知的表面活性最高的天然蛋白,具有很高的理论价值和应用价值。此外,研究数据初步显示真菌疏水蛋白既无细胞毒性,而且免疫原性较低,具有良好的生物相容性和安全性,在医药领域的应用有很大的潜力。本研究利用来自于食用蘑菇灰树花的真菌疏水蛋白HGFI作为固定化标签与来自于乳酸片球菌的片球菌素PA-1进行融合进行医用材料PCL的抗菌修饰,旨在利用疏水蛋白能够在界面处进行自我组装的性质,将抗菌多肽固定在医用材料的表面从而提高医用材料的抗菌能力,降低在医疗过程中细菌感染的风险。研究通过基因工程操作技术,将疏水蛋白HGFI与细菌抗菌肽片球菌素(PA-1)表达基因进行融合,以酿酒酵母作为表达宿主,通过表达质粒的构建和转化,筛选出能够外源表达目的融合蛋白PA-1-HGFI的宿主菌株。利用SDS-PAGE和Western blot技术对蛋白的表达进行了进一步的检测,并且通过亲和柱(His)进行了目的蛋白的纯化,以此作为后期研究的样品。随后,研究分别对融合蛋白中的PA-1的抗菌活性和HGFI的界面自组装性质进行了检测。以常见的条件性致病菌:藤黄微球菌,单核增殖李斯特菌及金黄色葡萄球菌作为指示菌,通过琼脂糖扩散法,生长曲线测定和扫描电镜观察等对融合蛋白中PA-1的活性进行了评估,结果证明PA-1能够保持其抗菌活性。对融合蛋白HGFI部分的界面吸附和自组装能力的研究利用了不同的测定方法。接触角测定证明融合蛋白同样具备改变界面亲疏水的性质,能够将PCL的强疏水表面转变为相对亲水。通过免疫荧光和多功能电子能谱(XPS)技术从半定量的角度证明了融合蛋白能够稳定地吸附在PCL的表面。原子力显微镜观察融合蛋白自组装成膜的结构发现其与疏水蛋白HGFI的结构有所不同,但是仍然能够以规则的微观结构存在,间接地证明了融合蛋白HGFI部分仍然具备其自组装的特性。最后对经融合蛋白包被修饰的PCL界面的抗菌和抗生物被膜能力进行了检测,结果表明经过融合蛋白修饰的PCL具有良好的抑制细菌生长的能力同时能够大大降低金黄色葡萄球菌生物被膜的产生,PCL的抗菌能力得到了大幅的提升。本次研究对医用材料抗菌界面的设计提供了一种全新的简单易行,生物安全和经济的操作手段,同时拓展了疏水蛋白和抗菌肽的应用研究领域。
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